末梢血細胞から循環腫瘍細胞を連続的に分離するための新しい統合マイクロ流体チップの設計

Scientific Reports volume 12、記事番号: 17016 (2022) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

がんは世界的に最も大きな死因の 1 つです。後期症状、アクセスできない診断、治療は先進国に共通の課題です。循環腫瘍細胞 (CTC) をできるだけ早期に検出し計数することで、より効果的な治療につながる可能性があると報告されています。 CTC が末梢血中に存在する可能性が低いため、初期段階で CTC を分離することは困難です。この研究では、流体力学的慣性集束と誘電泳動分離に基づいた、新しい 2 段階のラベルフリーの高速連続 CTC 分離デバイスを提案します。湾曲したマイクロ流体チャネル内の壁誘起慣性揚力とディーン抗力の優位性と差異により、CTC および白血球 (9 ～ 4 μm) から赤血球 (RBC) および血小板 (サイズ 2 ～ 4 μm) がサイズに基づいて分離されます。 12.2μm）。数値モデルを使用して、曲線マイクロチャネルにおける流体力学的慣性集束のメカニズムを調査しました。提案された設計のパラメーターの最適化された値を選択するために、RBC、血小板、CTC、および白血球 (4 つの主要なサブタイプ) を使用してシミュレーションが行われました。第 1 段階では、赤血球および血小板から白血球と CTC を選別するためにマイクロスケール細胞の集束挙動が研究され、第 2 段階では、誘電泳動を使用して、生存可能な CTC が固有の電気特性に基づいて白血球から分離されました。提案されたデバイスの設計は、数値シミュレーションを使用して CTC 分離効率について評価されました。この研究では、アスペクト比、誘電泳動力、チャネルサイズ、流速、分離効率、形状などの重要な要素が細胞分離に及ぼす影響を考慮しました。結果は、提案されたデバイスが 12.2 ml/h のスループットで 99.5% の分離効率で実行可能な CTC を生成することを示しています。

世界保健機関 (WHO) と世界がん観測所によると、2040 年までに、年間の新規がん症例数は 2,950 万人、がん関連死亡者数は 1,640 万人に増加すると予想されています 1,2。ほとんどの場合、がん細胞が全身に転移するまで、がんは診断され、治療されません3。その後、患者はすぐに再発し、生存率は非常に低くなります。循環腫瘍細胞（CTC）は、原発腫瘍、再発、または転移から脱落して末梢血中を循環する細胞であり、抗原性および遺伝性腫瘍特異的な特徴を持っています4。 CTC は、転移と呼ばれる体の他の部位で腫瘍の二次増殖を引き起こす可能性があります4。 CTC は、明確な形態学的および分子的特徴を持っています。それらは腫瘍発生の非常に初期段階から全血中に現れ始めます5。 CTC のアカウントを維持することで、病気の診断、モニタリング、個別化されたがん治療を実行できることがわかっています6。この事実を考慮すると、効果的な治療のために病気を早期に診断するには、まれな CTC (非侵襲性マーカー) を検出して評価することが不可欠です7。全血からの CTC の計数は、癌の初期段階の患者では欠乏しているため、非常に困難です。つまり、他の細胞と比較して 1 ～ 10 細胞/ml8、赤血球 5 × 109/ml、血小板 2 × 108/ml、および 1 ×白血球106個9．生存可能な CTC は、がんの進行を決定するためのさらなる下流の遺伝子型および表現型分析に必要です。がん細胞は形態が不均一であるため、その単離が技術的に困難になっています10。生存可能な CTC を特徴づけて分離するには、高感度の細胞選別装置が必要です。「リキッドバイオプシー」と呼ばれることが多い全血からの CTC の検出は、科学界および臨床界の注目を集めています 11。なぜなら、この方法には診断、予後、および治療効果の評価の可能性があるからです 12。現在までに、CTC の検出および分離のためにいくつかの方法が考案されています 13、14、15、16、17、18、19、20。分離技術は、CTC を全血から区別する生物物理学的特性を利用します。マイクロ流体セルソーターは、診断目的で最も一般的に使用されます。マイクロ流体技術は、マイクロチャネル内の流体輸送プロセスを調査するために使用されます。その利点としては、サンプルサイズが小さく、反応時間が短く、コストが低いことが挙げられます。同じ技術に基づく統合機能を備えたラボオンチップ (LOC) デバイスが、生物学的分析を実行するために開発されています 21、22、23。マイクロ流体セルソーターは、アクティブまたはパッシブに大別されます。能動的技術は、電気、磁気、光学、音響、生化学などの外部刺激を使用します22。受動的技術では、外力は加えられず、むしろ、サイズ、形状、チャネル構造、流体力学的な力などの固有の特性を利用します23。一部の技術では、分離前に CTC の標識が必要です 24,25。サンプルは、特定の細胞表面マーカー（蛍光標識、前染色、付着など）を使用して標識され、分離後の計数と視覚化が可能になります。研究者らは、CellSearch システムを含む CTC の列挙および検出方法の開発に焦点を当ててきました。上皮細胞に特異的な免疫標識技術、たとえば EpCAM やさまざまなサイトケラチンを使用して、主要な取り組みが行われてきました。ただし、EpCAM を発現していない、または上皮間葉移行 (EMT) を起こしている CTC を失うリスクがあります 4,26,27。

受動的慣性分離法は、シンプルで堅牢な設計による高スループットのラベルフリー分離を提供するため 28、より有望なものとなっています。慣性マイクロ流体工学では、曲線幾何学や収縮拡張アレイ (CEA) などの幾何学的変化により、マイクロチャネル内に横方向の二次ディーン流が誘発され、物理的属性に基づいて細胞が分離されます。この流体力学的分離では、血球の大規模かつハイスループットのろ過が使用され、非常に高い流量に対応できます。受動的な方法の人気にもかかわらず、これらには特定の制限があります。たとえば、サイズに基づいた分離の場合、細胞サイズの重複による CTC 内の白血球の汚染があります 29。異なるターゲットセルの異なる形状のため、設計は通常サンプルに基づいています30。能動的な方法、特に誘電泳動 (DEP) では、さまざまな外部電場と細胞の固有電気伝導率を使用して CTC を分離します。 DEP は、サイズと電気的特性に基づいて細胞を分離するアクティブな技術です。 DEP 力とは、不均一な電場によって誘電体および/または導電性粒子の誘導双極子モーメントに作用する力を指します 31、32、33。正常な末梢血細胞と、あらゆる種類のがんおよび固形腫瘍の CTC は、さまざまな電場に曝露されると一貫した誘電差を示します 17、19、34、35。したがって、DEP はより広範囲の細胞から CTC を正確に分離できます。この分離には細胞表面マーキングプロトコルは必要ありません。単離された CTC は未修飾または生存可能なため、がんの進行を決定するための分子特性評価に使用でき、一般に、より効果的な個別化療法の開発に役立ちます。 CTC と他の血球間の電気的特性の違いを利用して、特定の DEP ベースの選別装置が結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌などのさまざまな種類の腫瘍細胞の検出に使用されています。 DEP ベースの技術のほとんどは、全血ではなく、バイナリのスパイクサンプルを使用していました 36、37、38、39。これらの装置のサンプル調製は非常に面倒で複雑ですが、その一方で、全血の取り扱いも非常に困難です。 DEP 技術は正確な CTC 分離を示しますが、低スループット 40 や、血液の高い導電率によるチップベースの DEP マイクロ流体の分離効率の低下など、一定の制限があります 41。さらに、DEP によりデバイス内が加熱され、セルの電気的特性の変化やセルの損傷につながります42。

能動技術と受動技術の個々の制限と利点を考慮して、ハイブリッドマイクロ流体デバイスが提案されました。能動的および/または受動的な方法を組み合わせて複数の力を導入すると、両方の技術の制限を克服しながら、分離された細胞の高純度、高感度、およびデバイスの動作範囲の増加が得られました22。入手可能な公開文献では、多くの研究者が DEP を多くのアクティブおよび/またはパッシブ手法と組み合わせて CTC 分離効率を向上させています。 DEP は、磁気泳動、音響泳動、光泳動などの他の能動技術と並行して使用されてきました。最初に、DEP は、流体力学と DEP の力を使用してセルの平衡が達成されるフィールドフローフラクショネーション (FFF) と組み合わせられました。細胞はその密度と誘電特性に基づいて分離され、腫瘍細胞の動的物理的特性が測定されました43。

Moon らによる以前の研究では、DEP とマルチオリフィスフロー分別 (MOFF) 技術を組み合わせて、126 μl/分の高流速で MCF-7 乳がん細胞を RBC および WBC から分離しました 39,44。サンプルは、全血の遠心分離によって得られた WBC と RBC、およびスパイクされた CTC を使用して調製されました。報告された研究における CTC の分離効率は、連続分離における CTC の損失と RBC の汚染により 75.18% でした。彼らはかなり長い構成 (約 10 cm) を提示しました。

DEP とパッシブフィールドフロー分別 (FFF) 法を組み合わせたデバイスである Apostream は、7.5 ml の正常なヒトの血液から単離された末梢血単核球 (PBMN) を使用し、腫瘍細胞である卵巣がん SKOV3 細胞と乳がん MDA-MB-231 細胞をスパイクしました。それ。この装置からの腫瘍細胞の報告された平均回収率は、75.4% ± 3.1% および 71.2% ± 1.6% でした11。分離は改善されましたが、報告されたデバイスには、スループットの制限や、双極子間相互作用、クラスタリング、セルの混合を引き起こすセルの過負荷など、特定の問題がありました。

DEP-FFF はバッチモード処理のため、スループットが制限されています。研究グループは、長さ 160 mm、幅 25 mm の連続流マイクロ流体プラットフォームを導入しました。サンプルは、PBMN にスパイクされた標識済み MDA-MB-231 乳がん細胞を使用して調製されました。平均分離効率は 75% で、10 ml のサンプルを 1 時間未満で処理できます45。しかし、この大規模な構成により、同じ目的をより短い構成で達成できるかどうかという疑問が生じます。別の研究グループは、粒子分離のための DEP 慣性結合プラットフォームを発表しました。彼らは、垂直ネガティブ DEP (n-DEP) を備えた蛇行チャネル内でさまざまなサイズのポリスチレン粒子を使用しました。 DEP 力により粒子が浮遊し、流量と電圧をリアルタイムで変更することで、再設計を必要とせずに垂直方向に粒子の集束を行うことができます。彼らは、13 μm および 5 μm の粒子についてそれぞれ 100% および 96% の分離効率を報告しました 46,47。 DEP48 と併用したハイドロフォレーシスを使用した統合型細胞分離システムが報告されました。疎水泳動では、微細構造によって流体力学的圧力勾配が引き起こされ、懸濁液中の粒子を操作します。疎水泳動モジュールは微細構造を備えた蛇行チャネルに基づいており、DEP は傾斜した電極アレイを使用して適用されました。システムは、流速 3.5ul/min でマウス神経幹細胞から星状細胞に偏った細胞を分離するためにテストされました 49。血液のヘマトクリットが 1% を超えると、細胞間の相互作用が顕著になることがわかっています50。過負荷は血液サンプルを希釈することで解決できますが、この比率を超えると血液の pH が変化し、血球の生物学的特性 (細胞膜) の変化を促すため、最大 1:10 までに限られます 51。

血液の電気伝導率とそのヘモグロビンレベルには直接的な関係があります52。ヘモグロビンが全血から分離されれば、細胞の過負荷とジュール熱が減少します。したがって、ヘモグロビンを含む赤血球が全血から分離されると、残りのサンプルの DEP 分離中の伝導率、細胞の過負荷、およびジュール発熱が減少すると仮説を立てます。サンプルから赤血球と血小板を早期に分離すると、ヘマトクリットレベルが低下するため、細胞間相互作用の問題が回避されます。これにより、CTC 分離の処理時間も短縮される可能性があります。さらに、電場に長時間さらされると細胞にストレスが生じますが、これは、RBC や血小板などの他の血液細胞から CTC や WBC を事前に濃縮することで軽減できます。これは、単一プラットフォーム上の DEP ソーターに前処理ステージを追加することで実現できます。既存の技術では、DEP による選別前の事前濃縮に遠心分離プラットフォームが利用されています。しかし、以前の研究では、回転によって引き起こされる細胞毒性による細胞損失が報告されています53。さらに、遠心分離が遅れると、血液と勾配媒体が混合してしまいます。高速遠心分離は細胞にストレスを与え、白血球のタンパク質と遺伝子の発現を活性化し、変化させます54。同様に、RBC を除去するための血液サンプルの磁気選別は、多くのがん、特に上皮組織に由来するがんの表面タンパク質発現を調節し、表面抗原の変化により分離を困難にします 55,56。慣性マイクロ流体工学では、二次流れを制御するパラメータは、レイノルズ数 Re、ディーン数 K、およびチャネルのアスペクト比 AR57 です。したがって、これらのパラメータを操作することで、所望の効率と出力を備えたさまざまなデバイスを開発できます。一般に、機器は 1 つのサンプルに対する臨床関連手順の CTC の分析を 2 時間で完了する必要があると考えられています 58,59。これらの形状を組み合わせてディーン流を操作すると、構成が短くなり、分離プロセスが比較的短時間で行われる可能性があると仮説を立てています。 CTC の不足と末梢血サンプルの取り扱いの複雑さのため、研究者の大部分は、提案されたデバイスをテストするためにバイナリまたはスパイクされたサンプルを使用しています。このような実践は、全血サンプルの結果と比較すると有効ではない可能性があります。

この研究論文では、細胞の過負荷、細胞間相互作用、ジュール加熱、表面タンパク質発現の調節、細胞の損失、処理時間などの上記すべての問題が、マイクロ流体環境で DEP と統合された別の分離機構を使用して対処されています。我々はここで、慣性集束を使用して全血から赤血球と血小板を分離し、その後DEPを使用して白血球からCTCを分離するための、新しい2段階の連続的に統合されたマイクロ流体デバイスを提案します。提案されたハイブリッド法は末梢血を入力として受け取ります。このデバイスは、複数の方法の利点を組み合わせることで、セルの過負荷を軽減し、スループットと純度を向上させるように設計されています。別のステージを追加することでサンプル損失のリスクがなくなり、既存の方法と比較して分離効率が向上しました。この研究は、神経膠芽腫 (GBM) 腫瘍細胞を検出するためのマイクロ流体デバイスを設計することを目的としています。 GBM 細胞は拡散によって正常な脳領域に生息し、検出が失敗すると外科的治療が不可能となり、患者は 14.2 か月以内に死亡します60。公開文献では、GBM 細胞を分離するためのこのようなハイブリッド DEP デバイスについては議論されていません。

この文書の残りの部分は次のように構成されています。セクション II では提案されたデバイスの概念と設計について説明し、モデリングとシミュレーションの詳細はセクション III で提供されます。主な結果、関連する議論、設計パラメータの最適化については、セクション IV で説明します。結論はセクション V にあります。

提案された設計は、直列に統合された複合曲線慣性集束チャネル (パッシブステージ) と DEP 選別チャネル (アクティブステージ) で構成されます。第 1 ステージには 2 つの入口があり、1 つはサンプル注入用、もう 1 つは集束流、つまり緩衝液用です。注入されたサンプルと緩衝液は、分岐領域まで設計された組み合わせ形状に従い、そこから分離された CTC と白血球が第 2 ステージに送られ、一方、RBC と血小板は廃棄出口に蓄積されます。第 2 ステージの入口は、連続的な流れ場の条件を維持するために、第 1 ステージの出口と対称に構成されています。第 2 段階では、DEP を介して hGBM 細胞を選択的に分離します。第 2 ステージは、2 つの入口、1 組の電極、および 2 つの出口で構成されます。このステージの最初の入口は、分離されたセルが第 2 ステージの入力となるように、第 1 ステージの出口に接続されています。もう 1 つの注入口はバッファーの注入用です。 1 つの出口は CTC 収集用で、もう 1 つは WBC (廃棄物出口) 用です。図 1 は、パッシブステージとアクティブステージが統合されたマイクロ流体デバイスを示しています。

両方のステージが組み込まれた開発されたデバイスの 3D 概略図。血液サンプルが入口から導入されると、赤血球、血小板、T リンパ球、B リンパ球を含むほとんどの血球が慣性集束段階と第 2 段階で分離されます。最後に、希少な循環腫瘍細胞が DEP を使用して選択的に分離され、出口 II を通じて収集されます。残留白血球は廃棄出口 III から排出されます。

流体が湾曲した収縮長方形領域に入ると、その中の粒子は慣性揚力とディーン抗力を受けます。粒子の移動の方向と大きさは、粒子のサイズとこれらの力のバランスによって決まります。流路幅が高さよりも大きいため、側壁よりも上部と下部の間で高いせん断速度が発生します。これにより、強い慣性揚力により、粒子がチャネルの上部と下部に向かって移動します。したがって、チャネルのアスペクト比のサイズを変更することにより、せん断速度の変化、ひいては慣性揚力の変化により慣性分離を行うことができます。

慣性集束流は、壁誘起力、せん断勾配揚力、および二次流れ抗力という 3 つの主要な力によって支配されます。マイクロチャネルを通って流れる細胞は、その壁と相互作用して、(a) 流体よりも遅く移動し、(b) 細胞と壁の間に圧力が生じ、チャネル壁の反対側に向かう力が発生します。この力は、粒子とチャネル壁の間の距離に反比例します。方程式図 1 では、壁に誘発される揚力 61 を次のように説明しています。

ここで、v は流体密度 ρ と流体粘度 µ の比、r は粒子半径、D はチャネル壁間の距離、s は粒子から参照壁までの無次元化距離、d/D であるため、0 < s となります。チャネル内の粒子の場合は < 1、D1 と D2 は無次元壁距離 s の関数、n は参照壁の最も近い点における壁法線、I は単位行列、v は流体速度です。

典型的なマイクロ流体の速度プロファイルは放物線であるため、細胞は同時に異なる大きさの速度にさらされ、流体が細胞に対して剪断力を増加させる方向、つまりチャネル壁に力を誘導します。この力は式で表されます。 2.

ここで、C は定数、\(D_{h} = \frac{2wh}{{w + h}}\) は水力直径 (w は拡張領域の幅、h はマイクロ流体チャネルの高さ)、vm は最大チャネル速度。この方程式は、この力がチャネルのレイノルズ数と粒子の位置に依存するが、粒子の回転には依存しないことを示しています。シミュレーションで使用されるこのせん断勾配揚力は、62 によって提供されます。粒子のレイノルズ数 < 1 および放物線の流れを仮定すると、これらの揚力の合計の大きさは Evgeny63 によって提供されます。

ここで \(G\) は局所せん断速度、\(f_{L}\) は揚力係数として定義されます。この関数は、チャネル内の粒子の位置とチャネルのレイノルズ数に依存します。二次流れに関しては、特定の流路断面内の平衡位置の数を制御するために使用されます。式 4 は、これらの二次流れによって加えられる抗力を示しています。ストークス抵抗を仮定すると、64 で与えられます。

ここで、R は湾曲したチャネルの曲率半径です。この抗力は二次流速とセルサイズに直接比例します。ただし、これはチャネルの湾曲領域の曲率半径およびチャネルレイノルズ数に反比例します。

提案された設計では湾曲と CEA が利用されているため、形状が変化すると力も変化します。これら 2 つの力の間のバランスによって、粒子の最終的な平衡位置が決まります。粒子は慣性揚力の影響でチャネル壁と中心の間に位置する傾向があります。式 3 は、力がセル半径に比例して増加することを示しています。これにより、大きな粒子がチャネル壁に向かって移動します。一度そこに到達すると、これらの細胞はディーン抗力の影響を受けずに残り、チャネルの垂直方向の中心からの距離を維持します。より小さなセルは慣性揚力の影響を受けないため、半径方向のディーンフローの影響を受けて中心に向かって移動します。したがって、細胞はチャネル出口でのサイズに応じて分離されます。

累積揚力と抗力の比 \(\frac{{F_{L} }}{{F_{D} }}\) は、特定の直径のセルがチャネル内のどこで平衡するかを決定する要素です。力が支配するもの。この比率が > > 1 の場合、微粒子の慣性集束が起こり、< < 1 になると、大きな抗力によって粒子が混合されます 65,66。式 3 は、慣性移動強度がシステムパラメーターに依存し、セルサイズの 2 倍に正比例することを示しています。したがって、直径の大きな細胞はチャネル壁に向かって移動し、壁と中心の間のどこかで平衡位置に達する傾向があります。支配的な慣性揚力による細胞/粒子の集束は、ap /Dh の比 (ap は細胞の直径) に強く依存します 64,67。この比率では、同じレイノルズ数条件でのチャネル高さの変化により、水力直径が重要な要素となります。我々が提案したアプローチと仮説によれば、全血から赤血球と血小板（サイズ約 2 ～ 4 μm）を事前に効率的に分離することで、DEP 段階での CTC の分離と回収が促進される可能性があります。 Lee et al.68 の発見によれば、アスペクト比の低い CEA マイクロチャネルにより、直径 4 μm 未満の粒子を高い流量とスループットで分離できます。したがって、慣性マイクロ流体チャネルの収縮領域の低いアスペクト比を選択しました。すべての標的細胞の直径を考慮して、我々は最初に、低アスペクト比（AR = H/W）およびチャネル高さが 40 ～ 100μ の範囲のさまざまな Curved-CEA マイクロ流体チャネルを設計しました。慣性力の変調の影響を定量的に調べることにより、細胞の集束の挙動を研究しました。アスペクト比 0.8 ～ 2 の CTC の ap /Dh 比は、それぞれ 0.17 ～ 0.07 と計算されました。

残りの血球から分離した後、残留血球 (主に単球と顆粒球) を含む CTC は第 2 段階に進み、白血球から CTC を正確に分離するための積極的な技術が適用されます。 DEP 力とは、不均一な電場によって誘電体および/または導電性粒子の誘導双極子モーメントに作用する力を指します69。この力は、粒子の誘電率と周囲の流体の誘電率の間に差が存在する場合にのみ作用します。粒子にかかる誘電泳動力の強さは、懸濁液と粒子間の誘電率勾配に依存します。半径 rp の生物学的均質な球状細胞が媒体中に浮遊しながら変化する電場に置かれる場合、高次の分極を無視した総誘電泳動力は次のように推定できます 70

ここで、ε0 = 8.854187817 × 10−12 F/m は真空の誘電率、Re(CM) は媒質中の粒子の実効分極率の周波数変化を表すクラウジウス・モソッティ係数の実部です 44,69。それは、細胞の複素誘電率、懸濁媒体、および外部から印加される電場の周波数に依存します70,71。これは電界周波数の関数であるため、分離プロセスにおいて重要な役割を果たします。生体細胞は、脂質二重層細胞膜、細胞内構造、流体により均質ではないため、CM 係数を計算するために、細胞を薄い外層 (シェル) または細胞膜を持つ粒子と仮定して 70 で示される単一シェルモデルを検討しました。。薄層または細胞内構造および流体の内部の体積は、均一な導電率および誘電率を有すると想定されていますが、細胞膜の特性は細胞の他の部分の特性とは大きく異なる場合があります。シングルシェルモデルでは、DEP を計算する際、粒子の複素誘電率の代わりに、細胞の細胞膜と細胞質の両方を含む均質な粒子の同等の複素比誘電率が適用されます。細胞の複素誘電率が懸濁液の複素誘電率より大きくなる場合 \(\varepsilon_{p}^{*} > \varepsilon_{f}^{*}\)、それは正の DEP と呼ばれ、細胞を方向に引き寄せます。電極。対照的に、負の DEP は高電場の領域から細胞または粒子を反発します。

この研究では、負の DEP 反発を流体力学的集束と組み合わせて使用します。 DEP 分離の場合の分離メカニズムは、CTC が nDEP を経験する一方、残りの他の白血球は陽性 DEP または DEP なし (クロスオーバー周波数) を経験する AC 周波数を見つけることです。細胞に作用する DEP 力は細胞の体積に比例します。細胞に作用する全力 \(F_{T} = { }F_{DEP} - f\nu ,\) は、流体力学的抵抗力と反対の誘電泳動力によって与えられます。ここで、f はストークス抗力で、レイノルズ数が小さい場合は f = 6πηr で与えられ、ν は細胞懸濁液の流速です。細胞は粘度 η の媒体中で剛球体として扱われるため、DEP による速度は細胞半径の 2 乗に比例します。粒子の軌道は、流れ場内の力を計算した後に推定されます。流体中の細胞の運動は、ニュートンの運動の第 2 法則に従います 72。 DEP 段階のセルにかかる正味の力は次のように与えられます。

ここで、mp は細胞の質量、\({\text{v}} = d{\text{q}}/dt\) は細胞の速度、q は細胞の位置、FL、FD、Fdp、Fvm です。はそれぞれ揚力、抗力、圧力勾配、仮想質量力です。 CM 係数は、動作周波数に基づいて DEP 力の符号を指定します。図 2 は、hGBM および IV タイプの白血球の単一シェルモデルを使用した CM 係数と適用周波数の関係を示しています。粒子にかかる誘電泳動力の強さは、懸濁液と粒子間の誘電率勾配に依存します。 DEP ステージは、細胞懸濁液用のメインチャネルと CTC 用の 2 つの出口に沿った一連の櫛型電極で構成され、もう 1 つは白血球用の廃棄チャネルです。 CTC が電極に近づくと nDEP 力を受け、CTC が高電界領域から遠ざかり、最終的にコンセントに移動するように、適切な電圧と周波数が選択されます。一方、白血球は pDEP を受けて、もう一方の出口に向かって移動します。第 1 段階では血液（非ニュートン性）の大部分が除去されているため、第 2 段階では比誘電率 78、低導電率 0.055 S/m の 0.1 × リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を選択しました。チャネル幅が 50 μm から 175 μm に増加したため、粒子の速度が減少しました。この速度の低下により、すべての細胞が DEP 力にさらされるようになりました。また、チャネル断面全体の電場も減少し、生細胞の回収が可能になり、出口での細胞の分離が容易になりました。

hGBM および白血球のサブタイプの Claussius-Mossotti (CM) 因子の実部は、単一シェルモデルを使用して適用された周波数に対してマッピングされます。

COMSOL Multiphysics v5.5 はデバイスのモデリングに使用され、有限解析モジュールは数値流体力学 (CFD) シミュレーションの実行に使用されました。 COMSOL は、特定のアプリケーション領域に最適化された事前定義された物理モジュールを使用してモデルを構築および解決できる統合グラフィカルユーザーインターフェイス (GUI) を提供します。流体の流れ、微小電気機械システム (MEMS)、および電気回路モジュールを使用しました。 2D および 3D モデリングの目的は、流れ場を計算し、力を検証し、提案されたデバイス内の分離プロセスを視覚化することでした。形状の CAD モデルは、COMSOL の組み込み形状機能を使用して開発されました。

湾曲した CEA 慣性分離ステージの提案された設計は、Shamloo らの研究からインスピレーションを受けています。湾曲領域の初期幅は 50 μm、長さは 1950 μm ですが、拡張領域の幅は 350 μm、長さは 700 μm です。チャネル高さは５０μｍである。

ジオメトリ設計の次のステップは、モデルのドメインごとのマテリアルを定義することでした。 COMSOL は膨大な材料ライブラリによって補完されていますが、臨床試験に使用できる現実的なデバイス設計を開発するために、両方の分離段階に関連するヒト血液サンプルの物理パラメータが文献 73、76、77、78 とその値から抽出されました。この研究は、これまでに DEP 分離が公開文献で報告されていない脳腫瘍細胞またはヒト神経膠芽腫細胞 (hGBM) に焦点を当てました。

COMSOL モデルビルダーでは、流れシミュレーションプロパティがマイクロ流体ドメインで定義されました。速度ゼロの複数の領域によって発生する鋭い角のある領域の周囲に細胞が蓄積するのを避けるために、湾曲したエッジが使用されました。とがったエッジや鋭い角は細胞分離効率にとって最適ではないためです75。メッシュ要素の反転などのエラーを避けるために、慎重にメッシュ化が行われました。チャネルの鋭利で湾曲した領域の周囲に非常に細かいメッシュが作成されました。提案されたジオメトリの計算領域を離散化するために、均一な四面体構造メッシュが使用されました。構造化メッシュは、慣性ステージのジオメトリを離散化するために使用されました。 145,046、177,149、669,078 個のグリッドまたは要素を使用してメッシュの独立性解析が実行されました (図 3)。結果の満足のいく収束は、細かいメッシュの場合は 1.28 μm、粗いメッシュの場合は 11.9 μm の間の要素サイズで得られました。指定された要素数に関連する最大エラー率は 1% 未満でした。

拡張領域の中心に引かれた垂直線に沿った速度分布 (y 成分) は、マイクロ流体チャネルの指定された領域の速度変化を示します。メッシュ収束解析は、145,046、177,149、および 669,078 個の要素またはグリッド (粗い、通常、および細かいメッシュ設定) を使用して実行されました。折れ線プロットは、1.28 µm グリッドサイズのメッシュの収束を示します。

流体流モジュールを使用して有限要素法 (FEM) を実装しました。層流シミュレーションから得られた結果は、粒子追跡モジュールの入力として使用されました。これにより、設計されたマイクロ流体ドメイン内に粒子の軌道が生成されます。続いて、シミュレーションソフトウェアを使用して支配偏微分方程式を解きました。ナビエ・ストークス方程式と運動量（非線形対流・拡散）方程式が流れ場分布に対して解かれました。低いアスペクト比の場合、ap/Dh は < 1 であると考えられるため、流速は 120 ～ 200 µl/min になるように選択されました。 2 つの入口は、血液サンプルおよび集束流のそれぞれ 20 および 200 μl/分の流量によって定義されています。ゼロ圧力境界条件がマイクロ流体チャネルの出口に適用され、非滑り境界条件が壁に使用されました。 Galerkin 最小二乗公式を使用して、常微分方程式 (ODE) 系を使用して支配的な非線形偏微分方程式を近似しました。流体の流れについては、離散化を伴う層流 (P2 + P2) が解析されました。これにより、粒子追跡モジュールでセルの動きを推定するために使用される仮想質量および圧力勾配力とともに、正味の慣性揚力および抗力が得られます。入口に注入される血液サンプルについては、7 つの細胞株を含む細胞のグループが選択されます: 24 個の RBC、12 個の Plt、12 個の WBC (顆粒球、単球、T リンパ球、B リンパ球)、および 3 個の CTC。上記の細胞 (縮小) 数は、人間の血液中の同じ細胞の実際の量に基づいています。粒子追跡モジュールでは、0.0001 秒の時間ステップによる時間依存の研究が実行されました。運動方程式は、壁補正を伴うストーク抗力、壁誘発およびせん断勾配を含む揚力、仮想質量、および圧力勾配力を考慮して解かれました。

この研究でモデルの比較に使用される一次ジオメトリは、湾曲領域と 1 つの拡張領域で構成されます。湾曲領域の初期幅は 50 μm、長さは 1950 μm ですが、拡張領域の幅は 350 μm、長さは 700 μm です。チャネル高さは５０μｍである。縮小ゾーンでは、アスペクト比 (AR = H/W) 1 が選択されます。この量は適切な分離にとって重要であるため、慎重に選択されています。まず、一次幾何学形状上のサイズ 4 および 10 μm の 2 つのモデル粒子のみを使用してシミュレーションを実行し (図 4)、その結果を Shamloo らによって報告された結果 (図 5 で詳述) と比較しました。は、入口で注入された CTC の総量に対する CTC 出口で得られた CTC の比率として決定できます。シミュレートされたモデルは、分離ギャップのある最大細胞濃度の位置を示します。細胞の分離を視覚化するために、図 4 では粒子をサイズに基づいて色付けしました。

単一の収縮した湾曲と拡張された低アスペクト比 AR アーキテクチャを使用したプライマリジオメトリのシミュレーション結果。サイズ 4 および 10 µm のモデル粒子がシースフローで注入されました。シミュレーションでは、目に見える分離ギャップによる粒子の分離が示されています。

一次幾何学シミュレーション結果と文献で入手可能なデータの比較。 4 ～ 10 μm の粒子間の平均分離ギャップと収量は、実行されたシミュレーションの方が大きいことがわかりました。ただし、両方のセルサイズの純度は報告されたデータと同様でした。

この比較は合理的ですが、研究中の異なる細胞サイズと DEP ステージの連続統合のため、同じ設計は hGBM 分離には機能しませんでした。したがって、慣性集束ステージの分析手順を確立した後、幾何学的な変更を組み込むことによって、白血球および白血球から赤血球と血漿を分離するためのカスタマイズされた設計が完成します。さまざまなサイズと形状の分岐出口が設計され、赤血球、血漿の分離および収集のためにテストされました。、WBC、CTC。出口の初期設計は、ターゲットセル間の分離ギャップに基づいて行われました。遠心効果とツヴァイファッハ・フング分岐則80．図 6a ～図 6d は、分離効率と純度に生じた変化を示す出口のさまざまな設計を示しています。 (d) に表示されているデザインは、以前の結果を検証しながら最高の分離強度を示しました。したがって、慣性集束フェーズには分岐設計 (d) が選択され、上部の出口は拒否された RBC と Plt 用であり、もう一方の出口は CTC と WBC をさらに分離するために輸送するために使用されます。設計が完了すると、分離効率と純度、つまり、さまざまなアスペクト比での、目的の出口に収集された細胞数とその出口の総細胞数の比率を決定するためにいくつかのシミュレーションが行われました。

さまざまな設計のアウトレットにより、慣性集束フェーズの選択が強調されます。分離効率を視覚化するために、粒子はサイズに応じて色付けされています。 (a) 出口は初期モデルの粒子の濃度ギャップに基づいて設計されています。 (b) 出口サイズの変更 (c) 廃棄物出口サイズの増加 (d) 出口の対称分岐により、残りの血球から CTC が効果的に分離されます。

ap /Dh ~ 0.1 付近で慣性力がディーン抗力よりも優勢になるため、細胞が集束し始めることが観察されました。このことから、他の血球からの CTC の分離は、高さ 70 μm 未満、レイノルズ数 Re が 18 以上の設計された湾曲 CEA 形状で行うことができると予測できます。

DEP 分離ステージのシミュレーションでは、電流、流体の流れ、および粒子追跡モジュールが使用されました。モデルは、定常定常状態、周波数領域、および過渡解析のスタディで構成されます。速度、圧力、交流電位分布場は定常スタディを使用して計算され、非定常スタディは DEP 力の影響を受ける粒子軌道を生成するために使用されました。電流物理学では、マイクロチャネルの壁に対して電気絶縁の境界条件が選択されました。電極の電位を定義すると、壁内の電極の位置がオーバーライドされます。製作可能な一辺80μmの正方形の電極を使用した。電場を生成するには、同じ電圧と交互の符号を持つ電極が使用されました。３．５〜５Ｖの範囲の電位を電極に印加した。電場を計算するには、細かいメッシュが選択されますが、流体の流れ場を解くために粗いメッシュが生成されます。解決策を改良するために、鋭い角の近くで異なるメッシュが使用されました。流体の流れの定常研究では、代数マルチグリッドソルバー (AMG) またはプリコンディショナーが線形ソルバーとして使用され、電場は反復ソルバー BiCGStab を使用して計算され、ヤコビ法を備えた GMRES 反復ソルバーが細胞追跡に使用されました。粒子追跡の場合、DEP ステージのチャネル壁の境界条件は「バウンス」に設定され、出口条件は「スティック」に設定されました。これは、それぞれ、衝突の場合に細胞が跳ね返るか出口にくっつくことを意味します。第 1 段階の出口から分離された細胞 (CTC および WBC) は、第 2 段階のドメインに入ります。体積の大部分が慣性段階で赤血球および血小板とともに拒否されるため、集束フローにはさらに多くのバッファー (0.1xPBS) が必要でした。したがって、この段階では懸濁液は全体的にニュートン流であり、約 0.055 S/m の低い導電率を持っていました。このような構成は、pDEP 力と nDEP 力の両方を生成し、それぞれ細胞を電極に向かって、または電極から遠ざけるように移動させます。白血球とCTCの経路から、前者は電極の近くに発見されました。したがって、白血球には pDEP 力がかかり、CTC には nDEP 力がかかると結論付けることができます。

この論文では、最初に慣性マイクロ流体チャネルが Shamloo らの研究に基づいて数値的にシミュレートされました。 Shamlooらの調査結果を踏まえて基本形状を検証した上で、所望のサンプル、すなわち全血に応じて装置の設計を変更した79。検査された粒子は、12.2、6.58、9.26、9.42、4および2μmであった。直径は、それぞれ CTC、WBC (4 つの主要なタイプ)、RBC、および血小板を表します。最適な設計パラメータを見つけるために、チャネルのアスペクト比、流量、分離効率の関係が研究されました。その後、DEP ステージが個別に設計され、全血サンプルからの CTC 分離を促進および改善するために慣性マイクロチャネルと連続的に統合されました。

提案されたモデルは、湾曲した収縮拡張アレイ (CEA) 分離ジオメトリを利用しています。マイクロチャネルが湾曲している場合、またはそのアスペクト比が変化している場合（例えば、それぞれ曲線幾何学形状およびCEA）、追加の慣性力が導入される。このような幾何学的変化は、マイクロチャネル内に横方向の二次ディーン流を誘発します。結合されたアーキテクチャは、直線 CEA ジオメトリと比較して、より短い特有の長さで分離レベルまでディーン流渦を強化するように設計されています。当初は、RBC、Plt、WBC、および hGBM の 4 つの細胞株のみが検討されました。チャネル内で生成された 2 つのディーン渦 (図 7) が互いに強め合い、その結果、CTC の最大の分離効率と純度が得られる最大速度の大きさが得られます。

二次流れ渦またはディーン流れ渦が湾曲したチャネル内に現れ、最大速度の大きさを達成するために幅に沿って強度が変化します。矢印はディーン抗力を示します。抗力と慣性揚力の間のバランスにより、粒子のサイズに応じてチャネルを横切る粒子の最終的な方向が決まります。小さな粒子は流れの流線に沿って上部の出口に向かって移動し、大きなサイズの粒子は下部の出口に向かって移動します。

入手可能な文献のほとんどは、白血球の平均直径を考慮しており、白血球または白血球の実際の変異体を無視しています。これにより、結果に固有のエラーまたは制限が追加されます。実際の条件を考慮して、モデルに WBC のサブタイプ (単球、T リンパ球、B リンパ球、顆粒球) を追加しました。機械的および誘電的特性は、WBC (顆粒球および単球) を CTC から分離するために利用されています。我々の分析は、CTCのみがチャネルの右側に集中しているのに対し、他の細胞は左側に蓄積していることを示しています（図8）。前述したように、大きなセル、つまり CTC は慣性揚力の影響を受け、チャネル壁に対してほぼ一定の位置にセルを保持します。逆に、湾曲領域で生成されたディーン流は、残りの小さな細胞をステージ 1 の出口 #2 に向かって集中させます。図 8 は、粒子追跡モジュールからの細胞の軌跡を示しています。興味深いことに、T リンパ球と B リンパ球 ( 6.58μm）はRBCおよびPltとともに分離され、顆粒球および単球はCTCとサイズが同等であり、CTCとともにDEPステージに送達されました。ＰｌｔおよびＲＢＣ（２〜６μｍ）に近いサイズを有する白血球がそれらと一緒に排出されることが観察された。一方、CTC (9 ～ 12.2 μm) に近い直径を持つ特定の種類の白血球は互いに仲良くなり、マイクロ流体デバイスの第 2 段階に進みます。これらの結果は、幾何学形状と曲線および CEA を組み合わせれば、より短い長さで必要な結果が得られるという私たちの仮説を検証しました。

白血球のサブタイプを考慮した全血サンプルの粒子追跡の結果。色の凡例は、射出される粒子のサイズを示します。拡張領域では、小さな粒子、つまり RBC と血小板の分離が大きな粒子、つまり CTC と WBC から起こり、それらはそれぞれの出口に向かって移動し続けます。しかし、白血球の特定のサブタイプは、赤血球および白血球を最初に拒絶するために、赤血球および白血球とともに廃棄出口に向かって移動することが観察されている。

提案された慣性ステージの性能を評価するために、0.8 ～ 2 の範囲のさまざまなアスペクト比での細胞懸濁液の分離効率と純度を計算しました。一般に、アスペクト比が 1 未満の場合、分離効率が低いことが観察されています。アスペクト比 1 では、第 1 段階の分離効率が 100% に上昇します (図 9)。アスペクト比 1 ～ 2 の間では、サイズが RBC に匹敵する特定の種類の WBC も出口 #1 に移動しました。全体として、アスペクト比 1 以上の場合、100% の赤血球と血小板の分離効率が得られます。81 によって報告されているように、最大の分離効率の場合、ap/Dh 比の閾値は ~ 0.1 であることが観察されています。

赤血球と血小板の分離効率とアスペクト比。提案された組み合わせジオメトリの低い AR は、最大の分離効率に適していることがわかりました。

２段階マイクロ流体デバイスの速度場分布を図１０に示す。表面プロットは、流体が拡張領域に移送され、次に対称の分岐した下流チャネルに移送されるにつれて速度が減少することを示している。これは流体の動圧に直接関係する油圧抵抗によって起こります。速度の大きさは、二次流れの渦の強さの変化と、チャネルを通る幾何学的変化により変化します。チャネル幅が 50 μm から 175 μm に増加したため、粒子の速度は減少しました。この速度の低下により、細胞の速度が低下し、DEP 力にさらされるようになりました。また、チャネル内の電場も減少し、生細胞の回収が可能になり、出口での細胞の分離が容易になりました。

提案されたハイブリッドデバイスの速度場分布。速度の表面プロットは、提案されたデバイス内の速度フィールドをカラースペクトルで示します。集束バッファーが注入されると、その入口付近の速度が速くなります (赤い領域で表されます)。細胞懸濁液は低速で注入されたため、湾曲した収縮領域 (緑色の領域で表示) の流体流速度が低下しました。流体が拡張領域に入ると、速度がさらに低下します (青色の領域で表されます)。慣性ステージの最後では、単一のチャネルが分岐して分割され、体積流量が減少します。 DEP ステージのチャネルサイズはさらに増加します。この油圧抵抗の均等化により、DEP ステージ全体の流れの均一な分布が促進され、流体の流れのシミュレーションで均一な青色のスペクトルが得られます。

図 1 は、設計されたチャネル内で生成される流体の流れ、動的圧力、および速度を分析して連続的な細胞分離を保証するための DEP ステージの提案された設計を示しています。流れの効果的な連続性について、マイクロ流体チャネルの動的な流体圧力が検査されました。 DEP ステージは、印加電圧、周波数、電極数などのパラメーターによって制御されます。白血球と hGBM の CM 係数は、図 2 で適用周波数に対して計算されます。白血球、つまり単球、顆粒球、T リンパ球、B リンパ球のクロスオーバー周波数は 220 ～ 330 kHz の範囲です。ただし、hGBM のクロスオーバー周波数は 511 kHz 程度です。したがって、白血球からCTCを単離するには、pDEPを白血球に誘導し、nDEPをhGBMに誘導するために331〜500kHzの範囲の周波数を使用することができる。

我々は、pDEP に基づいて、最初に印加周波数を 350 kHz に固定することによって、白血球のすべての変異体間の挙動の違いがどの程度重要であるかを調査しました。電圧は広い範囲で変化させることができます。セルは高電界に弱いため、動作電圧は低い方が望ましいです。したがって、350 ～ 400 kHz の範囲の周波数と 2 ～ 5 V の電圧を使用して細胞分離プロセスを調べます。電圧と周波数の特定の組み合わせでは、CTC から白血球を分離するには、一定の数の電極が必要であることが観察されます。。 9 つの電極の使用により、370 kHz の周波数で十分な分離が確保されました。図 11 は、白血球または白血球から CTC が 99.5% 分離されたことを示す粒子の最終的な軌道を示しています。ビデオ 1。乳がんに関する非常によく似た種類の所見が、次の論文で報告されています。月と仲間たち。同様の方向で、結腸直腸癌と白血病も以前に報告されており、これらは我々の現在の発見を裏付けるものである 39,82,83,84。

粒子追跡の結果。 DEP段階で白血球からCTCを分離することに成功。慣性ステージからの白血球と CTC がランダムに分布した細胞懸濁液が DEP ステージの入口に入ります。色の線は細胞の軌跡を表し、青とその色合いは白血球を表し、CTC は赤で表されます。

この研究では、全血から CTC (hGBM) を分離するための、慣性集束と DEP に基づく、高度に特異的で連続的なラベルフリーの 2 段階マイクロ流体選別デバイスの設計とシミュレーションを実証します。現在の研究は、濃縮前のサイズベースの分離段階を追加することで DEP 法の限界を解決することを目的としています。濃縮前の段階では、小細胞 (通常は RBC と Plt) が血液量の大部分を占め、つまり 45% が分離されます。これらの細胞は血液の伝導性と非ニュートン性を担っています。初期段階でそれらを分離すると、CTC の分離純度と効率が向上します。残りの白血球と同等のサイズ (9.26 ～ 12.2 μm) を持つ CTC は DEP ステージに輸送され、そこで前述の細胞の電気的特性に基づいて分離が実行されます。得られた CTC は実行可能であり、診断や患者固有の治療法の考案にさらに利用できるため、提案された方法論がより有用になります。結果は、12.2 ml/hr の高スループットで 99.5% の純度レベルを示しています。分離効率を高めるために、提案された設計と統合を検証するためにいくつかの計算シミュレーションが行われました。この統合デバイスシミュレーションは、当社の 2 段階慣性 DEP デバイスを使用して細胞を効率的に選別することを実証しました。第 1 段階では、慣性集束技術を使用して血液サンプルから小さな RBC と Plt が分離されました。 CTC や白血球などの大きな細胞は、DEP 力を使用して互いに分離されました。研究者のほとんどは、スパイクされたサンプルまたはバイナリサンプルをテストに使用していましたが、これは臨床実践に固有の制限をもたらしました。全血サンプルと PBS を許容希釈率 1:10 で使用しました。我々は調査において CTC として hGBM を使用しましたが、我々の知る限り DEP 分離は報告されていません。ただし、提案されたデバイスは、DEP ステージの設計パラメータ、つまり印加周波数と電圧を変更することにより、他の種類の腫瘍細胞 (白血球に匹敵するサイズを提供) を分離するために使用できます。

提案されたデバイス設計には、ほとんどの種類の細胞分離法のサンプル調製中に発生する細胞の損失、細胞の断片化、細胞毒性、および細胞の変形の問題を克服するというコンセプトがありました。この研究では、遠心分離の代わりに慣性流分離法が使用されました。通常、遠心分離は臨床または研究室試験サンプルを調製するための前提条件として行われ、これが上記の問題を引き起こします。白血球とほとんどの CTC は同様のサイズであるため、慣性法は WBC や白血球の汚染により CTC 選別にはあまり一般的ではありません。本研究では、DEP 場に応じた動きに従ってさまざまな細胞型を分類するラベルフリーの DEP 法を使用しました。これは、セルの固有の誘電特性によるセルのクロスオーバー周波数の違いによるものです。この研究では 2 段階の方法を採用しており、これにより細胞数が減少し、また、低電圧と低周波数によりジュール加熱と細胞溶解の可能性が減少します。この方法は高い分離効率を持っていますが、処理量が少ないこと、過負荷によるセルの詰まりの可能性、および印加電圧によるジュール熱の問題があります。全体的な処理量が制限されるのは、シリアル統合によるものです。当社のデバイス設計は、全体的な分離効率または最大 99.5% の細胞回収率を実現します。全体として、私たちの現在のシミュレーション研究は、非常に効率的なデバイスの可能性を秘めていますが、サンプルの遺伝ベースの変動、人種や他の病気の存在による変動、およびサンプルの粘稠度、粘度、細胞毒性などに影響を与える可能性のある薬物療法に起因します。

この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究は、中国国家自然科学財団 (82170481)、安徽省自然科学財団 (2008085J39 および 2108085MH314)、安徽省自然科学財団教育委員会 (KJ2020A0728)、国家重点研究所（広西チワン族自治区）の支援を受けました。師範大学）（CMEMR2021-B03）、安徽省大学の優秀な一流人材育成プログラム（gxbjZD2022073）、薬学の主要分野（2019xjzdxk2）、および蘇州自然医学および機能性食品工学研究センター（SZ2017ZX06）。

パキスタン・ラホール工科大学メカトロニクス・制御工学部

マリハ・サリーム・バクシ＆モーシン・リズワン

パキスタン、ラホール、セントラル・パンジャブ大学薬学部薬理学・治療学科

グラム・ジラニー・カーン

生物食品工学部、北安徽省の本物の医薬品材料の開発と高価値利用のための工学研究センター、蘇州大学、蘇州、安徽、234000、中国

ホン・ドゥアン＆ケフェン・ザイ

医薬品資源の化学および分子工学の重要な実験室 (広西師範大学)、桂林、541004、中華人民共和国

ケフェンザイ

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BMS がアイデアを思いつき、研究を実施し、原稿を書き、KGJ がアイデアを概念化し、研究を整理し、原稿の本文を書き、DH が理解を明確にするために図 4、5、6、7、8、9 を用意しました。 RM は研究を監督し、原稿を審査し、ZKF は原稿を審査し、責任著者です。

Mohsin Rizwan、Hong Duan、または Kefeng Zhai への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Bakhshi、MS、Rizwan、M.、Khan、GJ 他。末梢血細胞から循環腫瘍細胞を連続的に分離するための新しい統合マイクロ流体チップの設計。 Sci Rep 12、17016 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-20886-1

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受信日: 2022 年 5 月 9 日

受理日: 2022 年 9 月 20 日

公開日: 2022 年 10 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-20886-1

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