インビトロ研究に基づくシャルカシ鶏の精子レオタキシス、凝集、束形成に関する新たな洞察

Scientific Reports volume 12、記事番号: 13003 (2022) この記事を引用

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鳥類の繁殖力は、精子貯蔵細管 (SST) 内に生存可能な精子の十分な集団を長期間貯蔵できるかどうかに依存します。精子が SST に侵入し、存在し、SST から出ていく正確なメカニズムについては、まだ議論の余地があります。シャルカシ鶏の精子は凝集する傾向が高く、多くの細胞からなる運動性の糸状の束を形成しました。不透明な卵管内で精子の運動や挙動を観察することは難しいため、精子の凝集や運動挙動の研究を可能にする精液腺の断面に近いマイクロチャネル断面を備えたマイクロ流体デバイスを採用しました。この研究では、精子束がどのように形成され、どのように移動し、SST内での精子の滞留を延長する上で精子束がどのような役割を果たしているのかについて議論しています。静水圧（流速 = 33 µm/s）によってマイクロ流体チャネル内に流体の流れが生成されたときの精子の速度とレオタキシスの挙動を調査しました。精子は流れに逆らって泳ぐ傾向があり（正のレオタキシス）、精子束は孤独な精子に比べて速度が著しく低かった。精子束は螺旋状の動きで泳ぎ、より多くの孤独な精子が補充されるにつれて長さと厚さが増大することが観察された。精子束は、33μm/sを超える流体流速で掃引されるのを避けるために、マイクロ流体チャネルの側壁に接近して付着していることが観察された。走査型および透過型電子顕微鏡により、精子束が大量の高密度物質によって支えられていることが明らかになった。この研究結果は、シャルカシニワトリの精子の独特の運動性と、精子が凝集して運動性の束を形成する能力を示しており、SSTでの精子の長期保存についての理解を深めることができる。

人間やほとんどの動物が受精するには、精子と卵子が正しいタイミングで受精部位に到達する必要があります。したがって、交尾は排卵前または排卵中に行われなければなりません。一方、犬などの一部の哺乳類や、昆虫、魚、爬虫類、鳥類などの非哺乳類は、卵子が受精する準備が整うまで、生殖器官に精子を長期間貯蔵します（非同期受精1）。）。鳥は、卵子と受精できる生存可能な精子を 2 ～ 10 週間維持することができます2。

これは、交尾と排卵を同期させる必要がなく、数週間にわたる 1 回の授精で高い確率で受精できるため、鳥類を他の動物と区別するユニークな特徴です。精子貯蔵管（SST）と呼ばれる主要な精子貯蔵器官は、子宮膣接合部の内部粘膜ひだに位置しています3。現在までのところ、精子の侵入、滞留、および精子貯蔵所からの排出のメカニズムは完全には理解されていません。以前の調査によると、これについては多くの仮説が提案されていますが、どれも確認されていません。

Forman4 は、精子は SST の上皮細胞上にあるタンパク質チャネルを流れる流体の方向に逆らう連続振動運動 (レオタキシス) によって、SST の内腔内での滞留を維持していると提案しました。精子を SST 内腔内に維持するには継続的な鞭毛活動が必要であるため、ATP が枯渇し、最終的には精子が体液の流れによって精子貯蔵所の外に運ばれ、卵管を上昇して受精する新たな旅を始めるまで、運動性が低下します。卵子 (Forman4)。この精子貯蔵モデルは、免疫細胞化学によって SST 上皮にアクアポリン 2、3、および 9 が存在することが確認された発見によって裏付けられています 5。現在までのところ、ニワトリの精子レオタキシス、およびそれが SST の貯蔵、膣内の精子の選択、および精子の競争において果たす可能性のある役割に関する研究は不足しています。ニワトリでは、自然交尾後、射精された精子が膣内に堆積されます。ただし、精子の 80% 以上は交尾直後に膣から排出されます6。これは、鳥類において膣が主要な精子選択部位であることを示唆しています。さらに、膣に授精された精子のうち SST に入るのは 1% 未満であることも報告されています 2。ニワトリの膣内に人工授精すると、授精後 24 時間で SST に到達した精子の数が増加する傾向がありました。これまで、このプロセスにおける精子選択のメカニズムは不明であり、精子の運動性がSSTへの精子の取り込みに重要な役割を果たしている可能性があります4。鳥類では卵管壁が厚く不透明であるため、卵管内の精子の運動性を直接監視することは困難です。したがって、私たちは、授精後に精子がどのようにSSTに移されるかについての基本的な知識を欠いています。

最近、レオタキシスは哺乳類の生殖器における精子輸送を制御する重要な因子であると考えられています7。生存可能な精子が流れに逆らって移動する能力に基づいて、Zaferaniら8は、マイクロ流体囲いシステムを使用して、囲い内の精液サンプルから運動精子を受動的に分離した。この精子の選別は医学的不妊治療や臨床研究に必要であり、時間と労力がかかり、精子の形態や構造の完全性に悪影響を与える可能性がある従来の方法と比較して好まれています8。しかし、これまで、ニワトリの生殖器内の流れが精子の運動性に及ぼす影響についての研究はありませんでした。

SST に保存された精子を維持するメカニズムに関係なく、多くの研究者は、ニワトリ 9、10、ウズラ 2、七面鳥 11 の SST 内で常在精子が「頭と頭」で凝集し、凝集した精子の束を形成していることを観察しています。著者らは、この凝集とSST内での精子の長期保存との間に関係が存在することを示唆した。

Tingari と Lake12 は、鶏の精子宿主腺内の精子間の密接な関連性を報告し、鳥類の精子が哺乳類の精子と同じように凝集するかどうかに興味を持っていました。彼らは、精子腺内の精子細胞間の深いつながりは、狭い空間に多数の精子が存在することによって引き起こされる圧力によるものである可能性があることを示唆しました。

新鮮なハンギングドロップスライドで精子の挙動を評価すると、特に精液滴の縁に沿って一時的な凝集の証拠が見られました。しかし、凝集は継続的な運動に伴う渦巻き作用によって頻繁に中断され、この現象の一時的な性質を説明しています9。研究者らはまた、希釈液を精液に添加すると細長い「糸状」の細胞凝集が見られることにも気づいた。

精液腺をシミュレートする初期の試みは、懸垂ドロップスライドから繊細なワイヤーを取り外すことによって行われ、これにより精液滴から精液腺と同様に細長い小胞が突き出ました9。精細胞は小胞内で瞬時に平行パターンに並びましたが、三次元の制限により全体のユニットはすぐに消えてしまいました。したがって、精子の凝集を研究するには、隔離された精子貯蔵細管内で精子の動きや挙動を直接観察する必要がありますが、これを達成することは困難です。したがって、精子の運動性と凝集挙動の研究をサポートするには、精子腺をシミュレートするツールを考案する必要があります。 Brillard ら 13 は、成熟した鶏の精子貯蔵細管の長さの平均は 400 ～ 600 μm ですが、一部の SST では 2000 μm に達する可能性があると報告しています。メロと小笠原 14 は、精子腺を肥大した精子貯蔵細管と肥大していない精子貯蔵細管に分類し、どちらも同様の長さ (約 500 μm) と首の幅 (約 38 μm) を持っていましたが、2 つのグループの尿細管の平均内腔直径は 56.6 と 11.2 でした。それぞれμm。現在の研究では、拡大した SST にある程度近い断面を与えるために、チャネル寸法 200 μm × 20 μm (W × H) のマイクロ流体デバイスを使用しました。さらに、我々は、SSTの上皮細胞が流れの方向に逆らって泳ぐことによって内腔内に精子を維持する液体を生成する（レオタキシス）というフォーマンの仮説と一致するように、流れる液体中での精子の運動性と凝集挙動を研究した。

研究の目的は、卵管内の精子の運動性を観察する際の問題を克服し、動的環境における精子の流動性と挙動を研究する際の困難を回避することでした。ニワトリの生殖器内の精子の運動性をモデル化するために静水圧を生成するマイクロ流体デバイスが使用されました。

希釈した精液サンプル (1:40) をマイクロチャネルデバイス内に滴下すると、2 種類の精子の運動性 (単独精子と束精子) が認められました。さらに、精子は流れに逆らって泳ぐ傾向を示しました（正のレオタキシス、ビデオ 1、2）。精子束の速度は孤独な精子の速度よりも遅いものの (p < 0.001)、陽性のレオタキシスを示す精子の割合が増加しました (p < 0.001; 表 2)。正のレオタキシスの割合は、孤立した精子と束についてそれぞれ約 53% と 85% と推定されました。

シャルカシ鶏の精子は、射精直後に数十個体からなる糸状の束を形成することが観察されました。これらの束は時間の経過とともに長さと厚さが増加し、分散するまで数時間インビトロに留まることがあります (ビデオ 3)。これらの糸状の束は、精巣上体の末端部分で形成されるハリモグラの精子の形状に似ています。シャルカシ鶏の精子は、採取後 1 分以内に凝集して網状の束を形成する傾向が高いことが判明しました。これらの束は運動性があり、隣接する壁や静止した物体に貼りつくことができます。精子束は精子の速度を低下させますが、巨視的には精子束の直線性が増加することは明らかでした。束の長さは、束に集まった精子の数に応じて異なります。束の 2 つの部分が認識されます。凝集した精子の自由頭部を含む最初の部分と、尾部と遠位精子全体を含む末端部分です。高速カメラ (950 フレーム/秒) を使用して、束の最初の部分にある凝集精子の自由頭部が、その振動運動によって束の運動性を担っており、それが残りの精子を引きずっていることを観察しました。螺旋状の動きで束ねます (ビデオ 4)。しかし、長い束では、体内に付着した精子のいくつかの自由頭と束の末端部分がパドルのように機能し、束の動きを助けることが観察されました。

精子束は、遅い流体の流れの中に存在する場合、互いに平行に移動した。しかし、流れの速度が増加すると、流れに押し流されないように、それらは重なり始め、静止した物体に付着し始めます。束の形成は少数の精子が互いに接近することから始まり、それらは同期して動き始め、互いに巻きつき、その後粘着物質に付着します。図 1 と 2 は、精子が互いに接近し、尾部が互いに巻き付くことで接続点を形成している様子を示しています。

研究者らは静水圧を加えてマイクロチャネル内に流体の流れを作り、そこで精子のレオタキシスを研究した。寸法 200 μm × 20 μm (W × H) および長さ 3.6 μm のマイクロチャネルを使用しました。端に注射器が取り付けられたリザーバ間のマイクロチャネルを使用した。チャネルをより見やすくするために、食品の色が使用されました。

壁への相互接続と付属品を束ねます。位相差顕微鏡から撮影したビデオ。プレゼンテーション用に、位相差顕微鏡による画像と図面が各画像に添付されています。 (A) 流れに抵抗する螺旋運動による 2 本の糸間の接続 (赤い矢印)。 (B) バンドルとチャネルの壁の間の取り付け (赤い矢印)。同時に、他の 2 つのバンドルに接続されます (黄色の矢印)。 (C) マイクロ流体チャネル内の精子束は互いに接続され始め (赤い矢印)、精子束の網が形成されます。 (D) 精子束のネットワークの形成。

希釈した精液をマイクロ流体デバイスに滴下すると、流れが発生し、精子束が流れの方向に逆らって移動することが観察されました。束はマイクロチャネルの壁に近づき、束の最初の部分の自由頭はマイクロチャネルの壁にしっかりと付着します (ビデオ 5)。また、流れに伴う漂流に抵抗しようとして、その経路にある破片などの静止粒子にも付着します。時間の経過とともに、これらの束は他の単一の精子と短い束を捕捉する長い糸になります (ビデオ 6)。流れが遅くなり始めると、精子の長い糸が精子の糸の網を作り始めました（ビデオ7、図2）。

高い流速（V > 33 µm/s）では、多くの個々の精子を捕らえて束を形成し、流れの漂流力によく抵抗しようとして、糸の螺旋運動が増加します。それらはまた、マイクロチャネルの側壁に付着しようとします。

精子束は、光学顕微鏡 (LM) を使用して、精子の頭部とコイル状の尾部の蓄積として同定されました。異なる集合体の精子束も、ねじれた頭部と鞭毛の集合体として、複数の精子の尾部が付着したものとして、精子の頭部が尾部に付着しているものとして、精子の頭部に曲がった核があるものとして、また、次のように同定された。透過型電子顕微鏡 (TEM) を使用すると、精子の複数の尾部が付着し、精子の頭部が凝集物質によって互いに付着した状態になります。走査型電子顕微鏡 (SEM) により、精子束は被膜で覆われた精子頭部の集合体であることが明らかになり、精子集合体には巻き付いた尾部のネットワークが表示されていました。

光学顕微鏡（半薄切片）、走査型電子顕微鏡（SEM）、透過型電子顕微鏡（TEM）を使用して、精子の形態と超微細構造、および精子束の形成を調査し、精液塗抹標本を染色しました。アクリジンオレンジを落射蛍光顕微鏡で検査しました。

精子塗抹標本のアクリジンオレンジ染色で示されるように (図 3B)、精子頭部は互いに接着し、分泌物質で覆われ、これにより大きな束が形成されました (図 3D)。精子束は、付着した尾部のネットワークを示す精子の集合体から構成されていました（図4A〜C）。精子束は、複数の精子の接着した包まれた尾部から構成されていました (図 4D)。分泌物 (図 4E、F) が束の精子頭部を覆っています。

位相差顕微鏡を使用した精子束の形成と、精子頭部がくっついていることを示すアクリジンオレンジ染色の精子塗抹標本。 (A) 初期の精子束の形成は 1 個の精子 (白丸) と 3 個の精子 (黄丸) から始まり、螺旋は尾部から始まり、最後に頭部に達します。 (B) アクリジンオレンジで染色した精液塗抹標本の顕微鏡写真。精子の頭部がくっついていることがわかります (矢印)。分泌物が頭を覆います（S）。倍率×1000。 (C) マイクロ流体チャネル内の流れを通って輸送される大きな束の展開 (950 フレーム/秒の高速カメラを使用)。 (D) 大きな束の形成を示すアクリジンオレンジ染色した精子塗抹標本顕微鏡写真 (矢印)。倍率：×200。

精子束とアクリジンオレンジで染色された精子塗抹標本の走査電子顕微鏡画像。 (A、B、D、E) はデジタル着色された精子の走査型電子顕微鏡写真であり、C と F はアクリジンオレンジで染色された精子塗抹標本の顕微鏡写真であり、複数の精子の付着した包まれた尾部のネットワークを示しています。 (A – C) 付着した尾部 (矢印) のネットワークとして示される精子の集合体。 (D) 付着した包まれた尾部の複数の精子 (凝集物質あり、ピンク色の輪郭、矢印)。 (E および F) 凝集物質 (矢頭) でコーティングされた精子頭部凝集体 (矢印)。精子はツイスター状構造をほとんど持たない束を形成しました (F)。倍率は(C)×400、(F)×200。

透過型電子顕微鏡を使用して、精子束には尾部が付着していること（図6A、C）、頭部が尾部に付着していること（図6B）、または頭部が尾部に付着していること（図6D）が示されました。束内の精子の頭部は曲がっており、切断面には核の 2 つの部分が存在していました (図 6D)。切断面の束では、精子は 2 つの核部分と複数の鞭毛部分を備えたねじれた頭部を持っていました (図 5A)。

デジタル着色された透過型電子顕微鏡写真。精子束の結合した尾部と精子頭部を結合する凝集物質を示しています。 (A) 多数の精子から付着した精子尾。尾部が縦方向 (矢印) および横方向 (矢印) ビューでどのように表示されるかに注目してください。 (B) 精子の頭 (矢じり) は尾 (矢印) につながっています。 (C) いくつかの精子の尾が取り付けられています (矢印)。 (D) 凝集物質 (AS、青色) が 4 つの精子頭部 (紫色) を接続します。

走査型電子顕微鏡を使用して、分泌物または被膜で覆われた束内の精子頭部を検出した(図6B)。これにより、精子束が細胞外物質によって保持されていることが明らかになった。凝集物質は精子の頭部（メデューサの頭部のような集合体；図５Ｂ）に集中し、遠位に伸びており、アクリジンオレンジで染色すると蛍光顕微鏡下で光沢のある黄色に見えた（図６Ｃ）。この物質は走査型顕微鏡を使用するとはっきりと見え、凝集物質と考えられます。半薄切片 (図 5C) とアクリジンオレンジで染色した精液塗抹標本から、精子束には密集した頭部とコイル状の尾部が含まれていることが明らかになりました (図 5D)。

さまざまな方法を使用した精子の頭部と包まれた尾部の凝集を示すさまざまな顕微鏡写真。 (A) 切断面の精子束のデジタル着色透過型電子顕微鏡写真は、核の 2 つの部分 (青色) と鞭毛のいくつかの部分 (緑色) を持つねじれた精子頭部を示しています。 (B) デジタル着色された走査型電子顕微鏡写真。コーティングされているように見える精子のクラゲのような頭部のクラスター (矢印) を示しています。 (C) 精子頭部の凝集 (矢印) と包まれた尾部 (矢頭) を示す半薄切片。 (D) アクリジンオレンジで染色した精子スミア顕微鏡写真は、精子頭部 (矢印) と巻き付いた付着尾部 (矢頭) の凝集を示しています。付着物質（S）が精子頭部を覆っていることに注意してください。倍率(D)×1000。

透過型電子顕微鏡を使用すると（図7A）、精子の頭がねじれていて、核がらせん状に似ていることもわかりました。これは、アクリジンオレンジで染色し、蛍光顕微鏡で観察した精液塗抹標本によって裏付けられました（図7B））。

(A) デジタル着色透過型電子顕微鏡写真、および (B) ねじれた頭部と精子の頭部と尾部の付着を示すアクリジンオレンジで染色された精液塗抹標本 (矢印)。 (B) 倍率×1000。

シャルカシの精子が凝集して、運動性の糸状の束を形成するという発見は興味深い。これらの束の特性は、SST での精子の取り込みと貯蔵においてそれらが果たす役割についての洞察を提供します。

交尾後、精子は膣に注入され、激しい選択プロセスを経て、限られた数の精子だけが SST に入るようになります 15,16。現在までのところ、精子が SST に入り、排出するメカニズムは不明です。家禽では、精子は種に応じて 2 週間から 10 週間の範囲の長期間にわたって SST 内に維持されます6。 SST 内での保管中の精子の状態に関しては議論が続いています。彼らは動いている状態ですか、それとも活動していない状態ですか? 言い換えれば、精子はどのようにして SST 内で長期間その位置を維持するのでしょうか?

Forman4 は、精子の SST への滞留と退出は精子細胞の運動性に基づいて説明できると提案しました。著者は、精子はSST上皮細胞によって生成される流体の流れに逆らって泳ぐことによってその位置を維持し、精子の速度がエネルギー不足により後退運動が始まる点を下回るとSSTから外に出ることを示唆しました。 Zaniboni5 は、SST 上皮細胞の頂端部分内にアクアポリン 2、3、および 9 が存在することを確認し、これはフォーマンの精子貯蔵モデルを間接的に裏付ける可能性があります。今回の研究では、シャーカシ精子のほぼ半数が流動流体の存在下で正のレオタキシスを示し、凝集により速度は低下するものの、凝集した精子束により正のレオタキシスを示す精子の数が増加することが判明した。精子が鳥の卵管をどのように上昇して受精部位に到達するのかは完全には理解されていません。哺乳類では、卵胞液が精子を化学誘引します7。しかし、化学誘引物質は精子を近づける距離に誘導すると考えられています7。したがって、精子の輸送には他のメカニズムが関与しています。精子が自らの向きを定め、交尾後に分泌される卵管液の流れに逆らって泳ぐ能力が、マウスにおける精子誘導を担う主要な要因であると報告されている7。 Parker17は、鳥類や爬虫類では精子が毛様体流に逆らって泳いで卵管を通過すると仮定した。鳥類の in vivo 実験では証明されていないが、Adolphi18 は、濾紙のストリップを使用して、カバーガラスとスライドガラスの間に含まれる液体の薄層に遅い電流が生成されると、鳥類の精子が正のレオタキシスを示すことを初めて観察した。日野と柳町19は、マウスの卵巣・卵管・子宮複合体を灌流カラーに装着し、峡部に墨汁1μlを注入して、卵管内の体液の流れを可視化した。彼らは、卵管内で非常に活発な収縮と弛緩の動きがあり、すべてのインク塊が卵管膨大部に向かって着実に移動することに注目しました。著者らは、精子の昇天と受精には、卵管の下部から上部への卵管液の流れの重要性を強調しました。 Brillard 20 は、ニワトリと七面鳥において、精子が蓄積される膣の入り口から、精子が蓄えられる子宮膣接合部までの精子の移動は、精子の活発な運動によって達成されると報告しました。しかし、精子は受動的移動によって輸送されるため、子宮膣接合部と漏斗の間ではこの運動性は必要ありません。これらの以前の提案と今回の研究で得られた結果の知識に基づいて、精子が流れに逆らって移動する能力 (レオタキシス) は、選択プロセスが行われる基礎となる属性の 1 つであると想定できます。そしてこれによって、精子が膣を通過し、SST に到達して保存されるかどうかが決まります。また、Forman4 の仮説のように、精子が SST に侵入し、一定期間滞留し、速度が低下し始めると精子が排出されるプロセスにも寄与している可能性があります。

一方、松崎と佐々波21は、鳥の精子は雄と雌の両方の生殖管で静止状態から運動性への運動性変化を受けることを示唆した。 SST 内に存在する精子の運動性の抑制は、SST から放出された後に運動性が回復する長期にわたる精子の保存を説明するために提案されました 21。松崎ら 1 は、低酸素条件下では、SST での乳酸の生成と放出が高く、これが常在精子の運動性の抑制につながる可能性があると報告しました。この場合、精子レオタキシスの重要性は精子の選択と取り込み中に現れますが、保存中には現れません。

精子の凝集様式は、家禽類に共通する精子の滞留パターンであるため、SST 内での精子の長期保存の納得できる説明であることが示唆されています 2,22,23。 Bakst et al.2 は、ほとんどの精子は互いに付着して束状の凝集を形成しており、ウズラの SST では孤立した精子はほとんど見られないことを観察しました。一方、Wen et al.24 は、ニワトリの SST 内腔では精子がより多く散在し、精子束がより少ないことを観察しました。これらの観察から、精子の凝集傾向は鳥種間、および同じ射精内の精子間で異なると推測できます。さらに、Van Krey et al.9 は、凝集精子のランダムな解離が、精子が卵管内腔へ徐々に出ていく原因であることを示唆しました。この仮定によれば、凝集能の低い精子が最初に SST から排出されるはずです。この場合、精子の凝集能力が、乱雑な鳥の精子競争の結果に影響を与える要因である可能性があります。さらに、凝集精子が解離するまでの期間が長ければ長いほど、受胎可能期間も長くなります。

精子の凝集とその束への付着はいくつかの研究で観察されているが 2,22,24 、SST 内で運動学的に観察するのは難しいため、まだ詳細には説明されていない。インビトロでの精子の凝集を研究する試みはほとんど行われていない。垂れ下がった精液を通して繊細なワイヤーを引き抜くと、広範囲ではあるが一時的な凝集が観察されました。これにより、液滴から細長い小胞が突き出て、精子腺を模倣しました。三次元の制限と液滴の乾燥にかかる時間が短いため、ユニット全体が急速に劣化しました9。シャルカシ鶏とマイクロ流体チップを使用した現在の研究では、これらの束がどのように形成され、どのように動くかを詳細に説明することができました。精子束は精液が採取されるとすぐに形成され、流れの中に存在すると螺旋状の動きをして泳ぎ、正のレオタキシスを示すことが判明した。さらに、肉眼的に観察すると、精子束は孤立した精子と比較して運動性の直線性を高めることが観察されました。これは、精子の凝集が SST の浸透前に起こる可能性があり、以前に示唆されたように、その形成が圧力によって狭い領域に限定されることはないことを示しています (Tingari および Lake12)。精子束の形成中、精子は結合部位を形成するまで同期して泳ぎ、その後、尾部は互いに巻きつき、精子の頭部は自由なままですが、尾部と遠位の精子は接着性物質によって互いに接着されます。したがって、バンドルのフリーヘッドは、バンドルの残りの部分をドラッグすることによって移動を担当します。精子束の走査型電子顕微鏡検査により、大量の接着性物質で覆われた付着した精子頭部が明らかになった。これは、精子頭部が保管場所（SST）に到達した後に発生する可能性のある静止した束で付着していることを示している。

精液塗抹標本をアクリジンオレンジで染色すると、精子を取り囲む細胞外接着物質が蛍光顕微鏡で観察できます。この物質により、精子束は周囲の表面や粒子にくっつき、周囲の流れに乗って漂流しないように付着することができます。したがって、我々の観察は、精子が運動性の束の形で付着する役割を明らかにするものである。流れに逆らって泳ぐ能力と、隣接する表面に付着する能力により、精子は SST 内に長時間留まり続けます。

Rothschild25 は血球計算盤チャンバーを使用し、顕微鏡の光軸が垂直および水平のときにチャンバーを通して顕微鏡写真を撮影することにより、懸濁液滴中の雄牛精子の遊泳分布を調べました。結果は、精子がチャンバーの表面に引き寄せられることを示しました。著者らは、精子と表面の間に流体力学的相互作用がある可能性があると示唆した。このことと、シャルカシ鶏の精子が粘着性の束を形成する能力を考慮すると、精子が SST 壁に付着して長期間保存される可能性が高まる可能性があります。

Baccetti と Afzeliu26 は、精子の糖衣が配偶子の認識と凝集に不可欠であると報告しました。 Forman10 は、家禽の精子をノイラミニダーゼで処理することにより、糖タンパク質-糖脂質コーティングのα-グリコシド結合が加水分解されると、精子の活力に影響を与えることなく生殖能力が低下することを観察しました。著者らは、ノイラミニダーゼによる糖衣の操作により、子宮膣接合部における精子の隔離が混乱し、その結果生殖能力が低下したのではないかと推測している。彼らの観察では、ノイラミニダーゼ処理が精子卵母細胞の認識を低下させた可能性を無視することはできませんでした。 Forman と Engel 10 は、鶏にノイラミニダーゼ処理した精子を膣内授精すると受胎率が低下することを発見しました。しかし、ノイラミニダーゼ処理した精子を用いた髄腔内授精は、対照鳥と比較して生殖能力に影響を与えなかった。著者らは、精子膜を取り囲む糖タンパク質・糖脂質被覆の変化は、子宮膣接合部における精子隔離を混乱させることによって精子の受精能力を低下させ、その結果、子宮膣接合部から精子が失われる割合を増加させるが、精子の受精能力は低下すると結論づけた。精子と卵母細胞の認識には影響しません。

Bakst と Bauchan11 は、七面鳥で SST の内腔に小さな小胞と膜の断片を発見し、これらの粒子の一部が精子膜と融合していることを観察しました。著者らは、これらの相互接続がSSTでの精子の長期保存に寄与しているのではないかと推測した。しかし研究者らは、これらの粒子の発生源が、SSTの上皮細胞から分泌されるものなのか、男性の生殖器系から産生・分泌されるものなのか、あるいは精子そのものからのものなのかは明らかにしていない。また、これらの粒子が凝集の原因となっているかどうか。 Grützner ら 27 は、精巣上体の上皮細胞が、単孔類の精子束の形成に必要な特定のタンパク質を産生および分泌していると報告しました。著者らは、これらの束の分散が精巣上体タンパク質の相互作用に依存していることも報告しました。 Nixon ら 28 は、精巣上体の分泌タンパク質である酸性システインに富んだオステオネクチンを発見しました。 SPARC は、ハリモグラとカモノハシの両方の精子束の形成に関与しています。これらの束の分散は、このタンパク質の損失に関連しています。

今回の研究では、電子顕微鏡を用いた超微細構造分析により、精子が大量の高密度物質に付着していることが明らかになった。これらの物質は凝集の原因であると考えられており、付着した頭部の間および周囲に凝縮されていますが、尾部領域では濃度が低くなります。射精時に精子がリンパ液や精漿から隔離されることが頻繁に観察されたことから、この凝集物質は男性の生殖器系（精巣上体または精管）から精液とともに分泌されると考えられます。家禽の精子が精巣上体と精管を通過するときに、タンパク質に結合する能力と血漿補液関連糖タンパク質を獲得する能力をサポートする成熟変化を受けることが報告されています 29,30。これらのタンパク質は SST 内の常在精子の膜上に存続しており、これらのタンパク質が精子膜の安定性の獲得に影響を与え 30、受精能力を決定する可能性があることが示唆されています 31。 Ahammad ら 32 は、雄の生殖器系のさまざまな部分 (精巣から精管遠位まで) から得られた精子は、保管温度に関係なく液体保管条件下で生存率が徐々に増加し、雌鶏の生存能力も増加したことを報告しました。人工授精後の卵管。

シャルカシニワトリの精子束は、ハリモグラ、カモノハシ、ウッドマウス、シカマウス、モルモットなどの他の種で発見されたものとは異なる特徴と機能を持っています。シャルカシ鶏では、精子束の形成により、個々の精子に比べて遊泳速度が低下します。ただし、これらの束は、正のレオタキシスを示す精子の割合を増加させ、動的環境で精子自身を安定させる能力を強化します。したがって、我々の発見は、SSTにおける精子の凝集が精子の貯蔵期間の延長と関連しているというこれまでの示唆を強化するものである。また、精子が束を形成する傾向がSSTによる精子の喪失速度を制御し、その結果、精子の競争の結果を変える可能性があると我々は推測している。この推測によると、凝集能の低い精子が最初にSSTを排出し、凝集能の高い精子を所有する雄が子孫の大部分を生成すると考えられます。単孔類における精子束の形成は有利であり、父子の比率に影響を与えますが、別のメカニズムが使用されます。ハリモグラとカモノハシでは、精子は束の前進速度を高めるために互いに平行に配置されています28。ハリモグラの束の運動性は、孤立した精子の運動性よりも約 3 倍速いです 27。ハリモグラにおけるこのような精子束の形成は、メスが無差別であり、通常複数のオスと交尾するため、優位性を主張するための進化的適応と考えられています。その結果、異なる射精物からの精子は、卵子を受精させるために激しい競争を繰り広げます33。

シャルカシ鶏の凝集した精子束は、位相差顕微鏡を使用して簡単に観察できます。これは、インビトロでの精子の挙動を簡単に研究できるため、有利であると考えられています。シャルカシニワトリにおける精子束の形成が生殖に利益をもたらすメカニズムは、キネズミなどの協力的な精子行動を示す一部の真獣類の哺乳類で見られるものとは異なります。そこでは、一部の精子は、他の関連個体が卵子に到達し、卵子に到達するのを助けて利他的な行動を示します。自身の肥沃な能力34．精子の協力行動の別の例はシカマウスで発見されており、精子は遺伝的に最も関連のある精子を認識して集合し、協力的なグループを形成して無関係な精子に対する速度を高めることができます35。

この研究で得られた結果は、SST内での精子の長期保存を説明するフォーマンの理論と矛盾するものではない。研究者は、精子はSSTを裏打ちする上皮細胞の流れに逆らって一定の運動をしながら長時間を過ごし、しばらくすると精子のエネルギー貯蔵庫が枯渇し、その結果速度が低下し、低エネルギーの排出が可能になると報告した。精子は、SST の内腔から卵管内腔へ流れる液体とともに移動します。今回の研究では、孤独な精子の半数が流れる液体に逆らって泳ぐ能力を示し、束になって付着することで正のレオタキシスを示す能力が高まることが観察された。さらに、我々の発見は、常在精子の運動性を抑制する可能性があるSSTにおける乳酸分泌の増加を報告した松崎ら1の発見と矛盾するものではない。しかし、我々の結果は、SSTにおける精子束の挙動を解明する試みとして、マイクロチャネル内の動的環境に存在する場合の運動性精子束の形成とそのレオタクティクス挙動を記述している。今後の研究はおそらく、凝集物質の化学組成と供給源の特定に焦点を当てることになるだろう。これは間違いなく、研究者が液体精子を保存し妊娠期間を延長するための新しい方法を考案するのに役立つだろう。

15羽の生後30週の裸首シャルカシ雄鶏（ホモ接合性優性；Na Na）が選択され、研究における精子ドナーとして使用された。鳥は、エジプト、アシュート県のアシュート大学農学部の研究養鶏場で飼育されました。鳥を個別のケージ (30 × 40 × 40 cm) に入れ、照明プログラム (16 時間明: 8 時間暗) にさらし、160 g の粗タンパク質、2800 kcal の代謝エネルギー、35 g のカルシウム、飼料1kgあたり有効リン5g。

腹部マッサージ法は、36,37 に従って雄鶏から精液を採取するために使用されました。合計 45 の精液サンプルが 15 人の男性から 3 日間にわたって収集されました。射精液（n = 15/日）を、二リン酸カリウム（1.27 g）、グルタミン酸ナトリウム一水和物（0.867 g）、フルクトース（0.5 g）、無水酢酸ナトリウム（０．４３ｇ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（０．１９５ｇ）、クエン酸カリウム一水和物（０．０６４ｇ）、一リン酸カリウム（０．０６５ｇ）、塩化マグネシウム（０．０３４ｇ）、およびＨ２Ｏ（１００ｍｌ）； pH = 7.5、重量オスモル濃度 333 mOsm/kg38。希釈した精液サンプルは、まず光学顕微鏡で検査して精子の質（活発な運動性）が良好であることを確認し、採取後 30 分以内に使用するまで 37 °C のウォーターバスに保管しました。

精子の運動学とレオタキシスは、マイクロ流体デバイスシステムを使用して説明されました。精液サンプルは、ベルツビル家禽精液増量剤でさらに 1:40 に希釈され、マイクロ流体デバイス (下記参照) にロードされ、特性評価のために以前に開発されたコンピューター支援精子分析 (CASA) システム 39 を通じて速度パラメータが決定されました。マイクロ流体環境における精子の動きの研究（エジプト、アシュート大学工学部機械工学科）。プラグインは URL: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39 からダウンロードできます。曲線速度 (VCL、μm/s)、直線速度 (VSL、μm/s)、および平均経路速度 (VAP、μm/s) を測定しました。精子細胞のビデオは、Tucson ISH1000 カメラに接続された位相差付き Optika XDS-3 倒立顕微鏡 (対物レンズ 40 倍) を使用し、30 フレーム/秒で 3 秒間撮影されました。 CASA ソフトウェアを使用して、サンプルごとに少なくとも 3 つのフィールドと 500 個の精子トラックが検査されました。録画したビデオは自社開発の CASA を使用して処理されました。 CASA プラグインの運動性の定義は、流体の流れではより信頼性が高いことが判明したため、左右の動きなどの他のパラメーターを含まず、精子の遊泳速度と流速に基づいています。レオタクティックな動きは、液体の流れの方向に逆らって泳ぐ精子として説明されました。レオタキシスを示す精子を運動精子の数で割った。静的な精子と対流によって押し流された精子はカウントから除外されました。

使用した化学物質はすべて、特に指定のない限り、Elgomhoria Pharmaceuticals (エジプト、カイロ) から入手しました。このデバイスは、El-sherry et al.40 によって説明されているように、いくつかの変更を加えて製造されました。マイクロチャネル製造用の材料には、ガラスウェーハ (Howard Glass、マサチューセッツ州ウースター)、SU-8-25 ネガレジスト (MicroChem、カリフォルニア州ニュートン)、ジアセトンアルコール (Sigma Aldrich、シュタインハイム、ドイツ)、およびポリジメチルシロキサン PDMS (Syllgard-184、ダウコーニング、ミシガン州ミッドランド）。マイクロチャネルはソフトリソグラフィーを使用して製造されました41。まず、必要なマイクロチャネル設計を備えた透明マスクを、高解像度プリンタ (エジプト、カイロの Prismatic およびオンタリオ州マーカムの Pacific Arts and Design) を使用して印刷しました。ガラスウェハーを基板として使用してマスターを作成しました。ウェーハをアセトン、イソプロピルアルコール、および脱イオン水で洗浄し、スピンコーティング (3000 rpm、1 分) によって厚さ 20 μm の SU8-25 層でコーティングしました。次に、SU-8 層をソフトベークし (65 °C、2 分間、および 95 °C、10 分間)、UV 光に 50 秒間露光しました。露光後ベークを 65 °C で 1 分間、95 °C で 4 分間実行して、露光した SU-8 層を架橋し、その後ジアセトンアルコールで 6.5 分間現像しました。ウェーハをハードベーク（200 °C で 15 分間）して、SU-8 層をさらに硬化させました。

PDMS は、モノマーと硬化剤を重量比 10:1 で混合して調製し、真空デシケーター内で脱気して SU-8 マスターに注ぎました。 PDMS をオーブンで硬化し (120 °C、30 分)、その後チャネルを切断し、マスターから剥がし、マイクロチャネルの入口と出口でチューブを接続できるように穴を開けました。最後に、他の場所で説明されているように、ポータブルコロナ処理装置 (Electro-Technic Products、イリノイ州シカゴ) を使用して、PDMS マイクロチャネルを顕微鏡のガラススライドに永久的に接着しました 42。本研究で使用したマイクロチャネルの寸法は、200 μm × 20 μm (幅 × 高さ)、長さ 3.6 cm でした。

マイクロチャネル内の静水圧誘起の液体の流れは、入口リザーバーの液体レベルを出口リザーバーよりも高さの差 Δh39 だけ高く保つことによって実現されました (図 1)。

マイクロチャネル内の平均速度は、Darcy-Weisbach 方程式を使用して計算できます。

ここで、f は長方形ダクト内の層流の f = C/Re として定義される摩擦係数です。C はチャネルのアスペクト比に依存する定数、L はマイクロチャネルの長さ、Vav はマイクロチャネル内の平均速度、Dh はチャネル水力直径、g は重力加速度です。この式を使用すると、チャネル内の平均速度は次の式で計算できます。

速度プロファイルはチャネル全体に形成され、アスペクト比が 0.5 未満のチャネルについては次の式を使用して計算されました。

ここで、V はチャネル内の任意の位置での液体速度、Vav は平均液体速度、a はチャネル幅、b はチャネルの高さ、y と z はそれぞれチャネルの高さと幅に沿ってチャネルの中心線から測定された 2 つの座標、mと n は次に従って計算される 2 つの数値係数です。

静水流生成は、マイクロチャネル内に流れを生成するためのシンプルで低コストの方法であり、シリンジポンプに特有の脈動流の影響を受けません 43。マイクロチャネル内の平均速度は、Darcy-Weisbach 式 44 を使用して計算できます。チャネル内の速度プロファイルは、アスペクト比が 0.545 未満のチャネルについて計算されました。平均液体速度は 33 ± 5 µm/s に保たれました。

精液の採取と希釈後、サンプル (n = 6) をカルノフスキー固定液 46 (表 1) に保存し、走査型電子顕微鏡による分析と半薄切片および極薄切片の樹脂作製のために各サンプルにつき 2 つのアリコートを作成しました。未固定サンプルを保持する他のチューブを利用して、アクリジンオレンジ染色で染色するための塗抹標本を調製しました。精液塗抹標本は、分泌小胞、膜結合酸性コンパートメント、酸性リソソームなどのタンパク質を含む膜小胞を染色するカチオン性染料であるアクリジンオレンジ染色によって染色されました。アクリジンオレンジは、緑と赤の蛍光の放出に関連する異染反応を起こします。アクリジンオレンジは膜に結合した小胞と反応し、小胞をオレンジ色または赤に染色します。アクリジンオレンジは、分泌小胞とリソソームの検出に使用されます 47、48、49、50。

ステインの成分蒸留水、アクリジンオレンジ、氷酢酸。

試薬の調製 50 mg のアクリジンオレンジのストック溶液を 10 ml の蒸留水で調製し、冷蔵庫に保管しました。作業溶液を作成するために、これを 50 mL の蒸留水中の 1 mL のアクリジンオレンジ原液および 0.5 mL の氷酢酸と混合しました。

染色方法きれいなスライド上に塗抹標本を作成し、風乾します。その後、スライドをメタノールで固定し、再度風乾した。次いで、それを、アクリジンオレンジ染色作業溶液（すなわち、０．０１パーセント）を含むトラフに２０分間置く。スライドを穏やかに洗浄し、乾燥させた後、外部蛍光ユニット（Leica EL 6000）を備えた顕微鏡（モデル Letiz DM 2500）を使用して分析しました。

2 滴の希釈した精液を Karnovsky 固定液で 4 °C で 2 時間固定した後、51 の指示に従って処理しました。固定では、等量のカルノフスキー固定液を希釈精液に 4 °C で 2 時間適用しました。

固定されたサンプルを遠心分離し、ペレットを新しい PBS バッファーに懸濁しました。リン酸緩衝液 pH 7-2-7-4 (表 1) で 3 回洗浄し、各洗浄後に遠心分離します。

室温で 2 時間、サンプルを遠心分離し、0 ～ 1 M リン酸緩衝液 (pH 7-2-7-4) および 2 ～ 5 mM 塩化カルシウムで調製した 10% 四酸化オスミウムで後固定しました。

サンプルを遠心分離し、ペレットを 50% エチルアルコールに懸濁して洗浄しました。最終遠心分離の後、ペレットを少量の50%アルコール中で完全に混合し、パスツールピペットに取り、高速濾紙(Whatman 41)の積み重ねの表面にゆっくりと滴下した。

液滴の間では、液体は濾紙に吸収されました。その結果、濾紙の表面に細胞物質の「山」が形成され、これを細いスパチュラで取り除き、2 ～ 4% 寒天プレート上に堆積させることができました。 60℃で、材料を溶融寒天で覆った。

標本の周囲の余分な寒天を除去した後、材料の「ブロック」を以下の 52,53 で示される方法で処理しました。グレードの高いエタノールアルコール (70%、90 p%、100I%、100II%) を使用して脱水し、エポンアラルダイトに埋め込まれています。エタノールとプロピレンオキシドの混合物を使用してブロックを脱水した。ブロックをエタノールの度合いを上げながら30分間、70分間一晩、90分間、100% Iで30分間、および100% IIで60分間脱水した。

樹脂の包埋は、プロピレンオキシド (Merck、ダルムシュタット、ドイツ) を使用して 30 分間、Epon : プロピレンオキシド (約 1:1 の比率) を使用して 30 分間、そして Epon を 3 時間使用して実行されました。 Epon は、5 mL の Epon 812 (Polysciences、エッペルハイム、ドイツ) を 5 mL のアラルダイトおよび 12 mL の DDSA と組み合わせることによって生成されました。

Epon を使用してブロックを移植し、その後 60 °C でインキュベートしました。 Epon ミックスと促進剤 (DMP-30) を使用してサンプルを重合しました (1.5%)。ブロックを次の温度で 3 日間インキュベートしました: 1 日目は 60 °C、2 日目は 70 °C、3 日目は 75 °C。

ウルトラミクロトーム Ultra Cut E (Reichert Leica) (四ホウ酸ナトリウム [ホウ砂] 1 g、トルイジンブルー 1 g、および蒸留水 100 ml) を使用して切断した半薄切片 (1 ミクロン) をトルイジンブルーで染色しました 54。染色された切片を、Leitz Dialux 100 顕微鏡を使用して検査した。写真はキヤノンのデジタルカメラ（キヤノンパワーショットA95）で撮影しました。

半薄切片から精子束のある部分を選んで超薄切片を作成しました。 Ultrotom® V を使用して極薄部分を切断しました (LKB Bromma、ミュンヘン、ドイツ)。 70 nm 切片を酢酸ウラニルとクエン酸鉛 55 で染色し、エジプト、アシュートにあるアシュート大学電子顕微鏡ユニットの JEOL100CX II 透過型電子顕微鏡を使用して研究しました。

精子束の発達は走査型電子顕微鏡 (SEM) を使用して観察されました。サンプル調製は、次のように 56 に従って実行されました。各サンプルは、Karnovsky 固定液 (表 2)46 で 4 ℃ で 4 時間固定されました。次いで、サンプルを遠心分離し、同じ固定緩衝液で洗浄（５回）した後、０．１Ｍリン酸Ｎａ緩衝液中の１％オスミン酸中で室温で２時間後固定した。それらを０．１Ｍリン酸緩衝液で１５回リンスした。濃度が 50、70、90、および 100 パーセントの昇順グレードのエタノールアルコールを使用してサンプルを乾燥しました (各濃度で 30 分)。各サンプルをアルミホイルボート上に分配し、固定し、次に空気乾燥させた。最後に、JEOL1100 E イオンスパッタリング装置を使用してサンプルを金でコーティングし、JEOL 走査型電子顕微鏡 (JSM5400 LV) を使用して KV10 で検査しました。

正確な構造を検出するために、走査電子顕微鏡写真と透過電子顕微鏡写真を Photoshop でデジタル着色しました。多くの著者がすでにこの方法論を採用しています55、56、57、58、59、60、61、62。

すべてのデータは平均値±SDとして表されました。ランクに関する Kruskal-Wallis ANOVA を使用して平均値を比較し、続いて Dunn の多重比較を使用しました。すべての統計は、JMP v5.0.1 (SAS キャンパスドライブ、米国ノースカロライナ州ケアリー) または GraphPad Prism v5 ソフトウェア (GraphPad Software, Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して計算されました。 P<0.05の差は有意であるとみなした。

我々は、クラスカル・ウォリス分散分析を利用して、さまざまなサンプルサイズの単独精子と束の動きを比較しました。この方法は、サンプルサイズが等しいか異なる 2 つ以上の独立したサンプルを比較するために使用されます。

この調査中に作成または分析されたすべてのデータは、この出版された論文に含まれており、著者からの要求に応じて入手できます。

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オーストラリアのシドニー大学の非常勤准教授であるジェフ・ダウニング博士は、徹底的な英語編集を担当し、作品を大幅に向上させました。著者らは彼に感謝したいと思います。

科学技術イノベーション資金庁 (STDF) がエジプト知識銀行 (EKB) と協力して提供するオープンアクセス資金。

これらの著者は同様に貢献しました:Taymour M. El-Sherry、Hanan H. Abd-Elhafeez、MAM Sayed。

アシュート大学獣医学部獣発生学学科、アシュート、71526、エジプト

テイモア・M・エル・シェリー

アシュート大学獣医学部細胞組織学科、アシュート、71526、エジプト

ハナン・H・アブド・エルハフィーズ

アシュート大学農学部家禽生産学科、アシュート、71526、エジプト

マム・サイード

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仕事は著者間で均等に分割されました。 TME、MAMS、HHA。調査研究、データ分析と解釈、画像整理、論文執筆を含みます。すべての著者は原稿の最終版を読み、承認しました。

ハナン・H・アブド・エラフィーズ氏への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

El-Sherry, TM、Abd-Elhafeez, HH & Sayed, MAM in vitro 研究に基づく、シャルカシ鶏における精子のレオタキシス、凝集、束形成に関する新たな洞察。 Sci Rep 12、13003 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-17037-x

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受信日: 2021 年 10 月 23 日

受理日: 2022 年 7 月 20 日

公開日: 2022 年 7 月 29 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17037-x

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科学レポート (2022)

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